O libreto de Mazeppa foi escrito por Viktor Petrovich Burenin, baseado no poema Poltava de Pushkin. Tchaikovsky fez alterações, no entanto, substituindo o texto de Burenin pelo de Pushkin sempre que possível, sem perder o foco do primeiro no personagem principal, Mazeppa, e sem abraçar o maior alcance histórico deste último. A ópera tem três atos e seis cenas, sua história se passa na Rússia do início do século XVIII. Maria, filha do rico cossaco Kochubei, declara seu amor pelo muito mais velho Mazeppa. Andrei então anuncia seu amor apaixonado por ela. Mazeppa pede a mão de sua filha a Kochubei, mas é negado. O esquema de Kochubei para revelar as intrigas anti-czaristas de Mazeppa ao czar sai pela culatra, levando-o a uma masmorra. Enquanto isso, Mazeppa revela seus planos a Maria, que nada sabe sobre a prisão do pai. Liubov, a mãe de Maria, informa-a sobre a situação de seu pai. Maria corre para salvar o pai, mas chega momentos depois de ele ser decapitado. Durante a Batalha de Poltava, Andrei embosca Mazeppa, que então atira nele. Maria conforta Andrei moribundo, enquanto Orlik arrasta Mazeppa.
