Le livret de Mazeppa a été écrit par Viktor Petrovich Burenin, basé sur le poème Poltava de Pouchkine. Tchaïkovski y a cependant apporté des modifications, remplaçant le texte de Bourénine par celui de Pouchkine autant que possible, sans perdre l'attention du premier sur le personnage principal, Mazeppa, et sans embrasser la plus grande portée historique du second. L'opéra est composé de trois actes et six scènes, son histoire se déroulant dans la Russie du début du XVIIIe siècle. Maria, fille du riche cosaque Kochubei, déclare son amour à Mazeppa, beaucoup plus âgé. Andrei lui annonce alors son amour passionné. Mazeppa demande à Kochubei la main de sa fille, mais celle-ci lui est refusée. Le plan de Kochubei visant à révéler les intrigues anti-tsaristes de Mazeppa au tsar se retourne contre lui et l'envoie dans un cachot. Pendant ce temps, Mazeppa révèle ses projets à Maria, qui ne sait rien de l'emprisonnement de son père. Liubov, la mère de Maria, l'informe du sort de son père. Maria se dépêche de sauver son père, mais arrive quelques instants après sa décapitation. Pendant la bataille de Poltava, Andrei tend une embuscade à Mazeppa, qui lui tire ensuite dessus. Maria réconforte Andrei mourant, tandis qu'Orlik entraîne Mazeppa.
