Das Libretto für Mazeppa wurde von Viktor Petrowitsch Burenin nach Puschkins Gedicht Poltawa geschrieben. Tschaikowsky nahm jedoch Änderungen daran vor und ersetzte Burenins Text, wo immer möglich, durch den Text von Puschkin, ohne den Fokus des ersteren auf die Hauptfigur Mazeppa zu verlieren und ohne den größeren historischen Umfang des letzteren zu berücksichtigen. Die Oper besteht aus drei Akten und sechs Szenen, ihre Geschichte spielt im Russland des frühen 18. Jahrhunderts. Maria, Tochter des wohlhabenden Kosaken Kochubei, gesteht der viel älteren Mazeppa ihre Liebe. Andrei verkündet daraufhin seine leidenschaftliche Liebe zu ihr. Mazeppa bittet Kochubei um die Hand seiner Tochter, wird jedoch abgelehnt. Kochubeis Plan, dem Zaren Mazeppas antizaristische Intrigen zu offenbaren, schlägt fehl und landet in einem Kerker. Unterdessen offenbart Mazeppa Maria seine Pläne, die nichts von der Inhaftierung ihres Vaters weiß. Liubov, Marias Mutter, informiert sie über die Notlage ihres Vaters. Maria beeilt sich, ihren Vater zu retten, trifft aber kurz nach seiner Enthauptung ein. Während der Schlacht von Poltawa überfällt Andrei Mazeppa, der ihn dann erschießt. Maria tröstet den sterbenden Andrei, während Orlik Mazeppa wegzerrt.
